PIPELINE D'ANALYSE DE VARIANTS

Il s'agit dune pipeline automatisé pour l'analyse et la visualisation de variants à partir de données de sequencage génomique (NGS). Dans notre exemple nous avons utilisé la sequence de reference de l'espece Mycobacterium tuberculosis. Cette pipeline permet notamment de :

• Quantifier les reads qui s'alignent sur le génome de M.uberculosis (Reference : AL123456)
• Identifier les variants et les SNPs présent
• Faire le filtrage et la visualisation des variants avec IGV

📝 Notes importantes

• Pour votre analyse remplacer les fichiers fastq et fasta par vos propres fichiers : Ce sont des données d'exemples pour la pipeline
• Installer tous les outils et fichiers dans les repertoires correspondant pour une meilleure efficacité
• Tous les scripts sont interactifs : Cette pipeline vous guide étape par étape jusqu'à la visualisation de vos variants
• Le filtrage DP ≥ 3 est le plus recommandé pour réduire les faux positifs
• L'ordre d'exécution des scripts est important (respectez la séquence indiquée)

Outils nécessaires

• BWA pour l'alignement de séquences
• Samtools pour la manipulation de fichiers BAM/SAM
• Bcftools pour la génération de fichiers BCF/VCF
• Kallisto pour la quantification des reads
• SnpsefF.jar pour le filtrage des SNPs

📦 Installation des outils

1. Installation BWA, Samtools et Bcftools

Methode 1 : En ligne de commande

sudo apt-get update

sudo apt-get install bwa

sudo apt-get install samtools

sudo apt-get install bcftools

Methode 2 : Via le dépôt github

Uitliser le lien pour recuperer les fichiers correspondant : https://github.com/COMBINE-lab/salmon/releases

2. Installation Kallisto

Méthode 1 :

sudo apt-get install kallisto

Méthode 2 : Compilation depuis GitHub

cd ~

git clone https://github.com/pachterlab/kallisto

cd kallisto

mkdir build

cd build

cmake ..

make

sudo make install

3. Télécharger snpEff

• wget https://sourceforge.net/projects/snpeff/files/snpEff_latest_core.zip
• unzip snpEff_latest_core.zip``

Utilisation de la pipeline

Partie A : Quantification avec Kallisto_tools

• Aller au niveau du repertoire kallisto_tools en utilisant la commande suivante : cd kallisto_tools/
• Puis executer le fichier sh suivant : ./Taux_Mapping.sh

Le script vous guidera dans votre demarche :

• Sélection du fichier FASTA de référence
• Création de l'index Kallisto si nécessaire
• Choix des fichiers FASTQ à analyser
• Génération automatiquement des statistiques d'alignement

Résultats attendus :

• Nombre total de lectures traitées
• Nombre de lectures pseudoalignées
• Taux de mapping (pourcentage d'alignement)

Les résultats seront ensuite transférer dans le dossier kallisto_output/

Partie B : Analyse des SNPs (Détection de variants)

Étape 1 : Conversion FASTQ → BAM

• Aller au niveau du repertoire sam_tools en utilisant la commande suivante : cd salmon_tools/
• Puis executer le fichier sh suivant : ./FastQ_TO_Bam.sh

Étape 2 : Tri et indexation des BAM

• Toujours dans le meme repertoire executer le fichier sh suivant :./Bam_Filtered.sh Cette étape :
• Trie les fichiers BAM par coordonnées génomiques
• Indexe les fichiers BAM triés

Visualiser des fichiers

• Pour les fichiers BAM non trié effectuer la commande suivante : samtools view aln-se.1.bam | head
• Pour les fichiers BAM non trié effectuer la commande suivante : samtools view aln-se-sort.1.bam | head

Étape 3 : Génération des fichiers BCF

• Toujours dans le meme repertoire executer le fichier sh suivant : ./Bam_To_Bcf.sh

Étape 4 : Génération et filtrage des VCF

• Toujours dans le meme repertoire executer le fichier sh suivant : ./Bcf_To_Vcf_Filtered.sh Cette étape :
• Convertit BCF → VCF
• Filtre les SNPs avec une profondeur de lecture ≥ 3 (paramètre modifiable)

🔍 Visualisation des résultats

Visualisation avec IGV (Integrative Genomics Viewer)

1. Installer IGV

• Téléchargez IGV depuis le site officiel :

https://software.broadinstitute.org/software/igv/download

• Ou installation via ligne de commande linus :

wget https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.16/IGV_Linux_2.16.2_WithJava.zip

unzip IGV_Linux_2.16.2_WithJava.zip

cd IGV_Linux_2.16.2

./igv.sh

2. Charger les données dans IGV

a) Charger le génome de référence :

• Menu : Genomes → Load Genome from File
• Sélectionner : AL123456.3.fasta

b) Charger les fichiers d'alignement et de variants :

• Menu : File → Load from File
• Sélectionner : aln-se-sort.1.bam (fichier BAM trié)
• Menu : File → Load from File
• Sélectionner : aln-se-sort-filter.1.vcf (variants filtrés)

3. Explorer les variants

• La piste BAM montre la couverture (coverage) et l'alignement des reads
• La piste VCF affiche uniquement les SNPs avec DP ≥ 3
• Zoomez sur une région pour voir les variants en détail
• Les SNPs présents sur moins de 3 reads ne sont pas affichés (filtrage)

📊 Résultats attendus

Détection de variants

Les fichiers VCF filtrés contiennent les SNPs détectés avec :

• Position chromosomique
• Nucléotide de référence
• Nucléotide alternatif (variant)
• Profondeur de lecture (DP)
• Qualité du variant

Auteur

• El Hadji Omar Dia
• GitHub : @Omar03-maker
• Mail : elhadjiomardia@esp.sn

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